《超级马里奥兄弟3》主要讲述马里奥、路易吉、蟾蜍和蟾蟾公主在蘑菇世界中的故事大部分剧集都围绕着这四个角色为阻止库巴国王和他的库巴小子占领蟾蜍公主的蘑菇王国所做的努力。这些库巴小子各自拥有不同的个性和能力，在动画中频繁制造麻烦，意图夺取蘑菇王国的控制权。每一集中，马里奥兄弟通过机智和勇气，化解库巴家族设下的各种陷阱，并保护王国的安全。动画中的剧情以幽默和轻松的方式展现，配合游戏中的经典元素，如超级蘑菇、无敌星和变身叶，带给观众一种熟悉感。虽然动画主要面向儿童，但它的幽默感和对游戏细节的忠实还原，使其在各个年龄段的观众中都广受欢迎。《超级马里奥兄弟3》不仅延续了马里奥系列的经典魅力，还帮助马里奥这个形象在全球范围内进一步流行，成为90年代最具代表性的电子游戏改编动画之一。
